1. 为什么实验结果无阳性或阳性弱？
1) 一抗和二抗不匹配，使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。确保一抗和二抗的同种型匹配（例如，IgY和IgG）。
2) 没有足够的一抗与目标蛋白结合，提高一抗用量,建议4℃过夜孵育，延长孵育时间,增强抗原抗体结合，背景更低。
3) 由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效，由于储存和使用不当，导致抗体效价降低或失活，提高抗体浓度仍无阳性可做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。
4) 样本中没有目标蛋白，通过查阅资料确认样本中是否存在某蛋白表达，若无可参考资料建议做阳性对照。
5) 样本中目标蛋白含量太少，应用信号放大操作，例如，使用生物素偶联二抗和偶联酶的链霉亲和素（SABC试剂盒）。
6) 脱蜡不彻底，延长切片脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。
7) 固定液封闭了抗体识别表位，固定时间过长会导致蛋白质空间结构发生折叠而遮盖抗原决定簇，可缩短样本固定时间，加强抗原修复。
8) 蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜，对样本进行破膜通透处理。
9) PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根，在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂，或使用新鲜无菌的PBS。
2. 为什么我的片子背景很强而且非特异性着色很严重？
1) 未封闭或封闭不充分，延长封闭孵育时间，考虑更换封闭剂。推荐使用二抗种属来源的10%正常血清封闭1小时，或使用5% BSA封闭30分钟。另一种选择是用针对样品种属的Ig进行预吸附处理的二抗。
2) 一抗浓度过高，针对一抗做浓度梯度实验，选择合适浓度，缩短抗体和底物孵育时间。
3) 孵育温度过高，时间过长，选择4℃过夜或缩短孵育时间。
4) 二抗质量不佳，使用不加一抗的二抗对照。如果观察到二抗对照有染色，则更换二抗或使用针对样品种属Ig进行预吸附处理的二抗。
5) 内源性过氧化物酶含量过高，延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min。
6) 固定过度，福尔马林/PFA通常会在绿光光谱内产生自发荧光，因此试着使用红光范围内的荧光素。
7) 注意实验操作细节，在所有步骤（除封闭）之间加强PBS充分洗涤，孵育时候切勿干片。
8) 通透作用破坏膜并除去了膜蛋白，使用较温和的去垢剂（例如，用Tween 20代替Triton X）。或去除缓冲液中的透化剂。
9) 一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织)，二抗会与同源的所有组织结合，使用种属来源不同于样本种属的一抗，或检测系统使用生物素直标一抗和酶偶联的链霉亲和素。
3. 为什么我的标本着色部位不对？
1) 胞浆抗原出现胞核有着色。降低反应强度，减少修复时间；由于组织固定过久，及时更换标本。
2) 胞核抗原只出现胞浆表达。核抗原不易暴露，加强修复来充分暴露。
4. 免疫组化实验如何设置对照实验？
原则上讲，所有实验都应该设置阳性对照，阴性对照，空白对照。
阳性对照主要是确保实验流程没有问题，各试剂质量过关，多用已有明确蛋白表达的组织。
阴性对照是已知不表达检测蛋白的细胞系或组织切片，确认染色结果的特异性。
空白对照一般多用一抗来源的动物血清，用以排除非特异背景染色。
不过，由于样本选取的复杂性，国内多数实验室以及国外多数小实验室，都无法做到规范的阴性对照，所以普遍以空白对照代替阴性对照，而这种方法也在国内外得到承认。
5. 免疫组化检测时，如何控制显色背景？
在显色时，一定要在镜下严格观察结果变化，而不是一味的看显色时间，当阳性强而低背景时可以终止显色。在显色之前充分洗涤浸泡，若背景仍高的话可以用热的PBS洗涤。
6. 在实验中如何有效避免修复后切片出现脱片情况？
载玻片进行多聚赖氨酸防脱片处理。②在切片后及时烤片。③避免修复时间过长。⑤有些组织易于脱片，如骨组织、皮肤组织等，可以把切片浸泡在加热修复液中烫片修复。
7. 封闭液如何选择？
封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。BSA一般也可以替代羊血清使用。
8. 你们的说明书上说一抗孵育可以是37℃2小时，也可以采用4℃过夜，那我到底应该采用哪种方法呢？
37℃2小时和4℃过夜的方法都可以得到较好的抗体孵育效果，但是37℃2小时孵育条件强，可能造成一些背景，所以如果安排方便的话，可以采用4℃过夜的方法，条件更加温和，而且结果的特异性更强，背景干净。
9. 显色后必须要进行苏木素复染吗？
苏木素主要是染细胞核，起一个定位的作用，更好判断阳性结果，这个不是必须要做的。
10. 抗体需要分装保存吗？
抗体比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不少于10μL每份。
1. 检测出的分子量与理论分子量有差异
1) 翻译后修饰，比如磷酸化，糖基化等， 这些变化会增加蛋白的大小。
2) 蛋白变性后复性引起的二聚体， 三聚体，四聚体等形式，分子量可能是单体形式的二倍，三倍，四倍等。
3) 蛋白活化后剪切，比如很多蛋白在合成的时候是作为前体蛋白合成的，然后剪切形成活性蛋白片段形式，实际分子量变小。
4) 蛋白的电泳表观分子量与理论分子量有差别，例如p53蛋白，其表观分子量是53kDa (这也是该蛋白名字的由来) ，但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。
5) 许多蛋白质有多个亚型， 分子量都不同。
6) 可能是胶变形引起的，比对Marker出现偏差。
7) 蛋白质的降解。
2. Western blot结果中背景较高
可能的原因及建议：
1) 膜封闭不够
答：延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2) 一抗稀释度不适宜
答：对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度，降低抗体浓度。
3) 一抗孵育的温度偏高
答：建议4℃结合过夜。
4) 检测时曝光时间过长
答：减少曝光时间。
3. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议：
1) 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
答：查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2) 目的蛋白有其它剪切本
答：查阅文献或生物信息学分析可能性。
3) 样本处理过程中目的蛋白发生降解
答：加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
4) 上样量过高，太敏感
答：适当减少上样量。
5) 一抗或者二抗浓度偏高
答：降低抗体浓度。
4. Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议：
1) 检测样本不表达目的蛋白
答：选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2) 检测样本低表达目的蛋白
答：提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3) 转移不完全或过转移
答：可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4) 抗体不能识别测试种属的相关蛋白
答：购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5) 一抗孵育时间不足
答：建议4℃结合过夜。
6) 二抗与一抗不匹配。
答：选择针对一抗来源的种属的抗体。
5. 问题：WB实验中的蛋白质条带强度不一致。
解析：蛋白质条带强度不一致可能是由于抗体和蛋白质结合效率不一致、蛋白质浓度不一致等原因造成的。要解决这个问题，可以调整抗体的浓度和反应的时间，优化蛋白质的提取和浓度测定方法。
6. 条带歪斜或漂移
如果可以排除电泳时条带已经歪斜，可能的原因是：1）“三明治”结构因为电转移装置长期使用，海绵垫变薄或操作时没有压紧，在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，导致电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，或者在电转移过程中膜或凝胶歪斜。2）电转移时转移液没有完全浸没凝胶和膜。
7. 转印的方法如何选择（半干还是湿转）
半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于转移电压和时间也有所不同。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。
两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD 以上）建议湿转。
8. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
9. 内参抗体怎么选择
内参抗体应遵循的原则：
1) 样本种属来源：
首先考虑实验样本来源于何物种。
a. 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β- actin、β- tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。
b. 其他稀少物种来源，可以参照文献指导或是选择高度保守管家基因表达的蛋白质相应的抗体作为内参。
2) 目的蛋白分子量：
选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上但勿差距太大。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β- tubulin作为内参。
3) 目的蛋白表达部位：
针对一般蛋白质检测，GAPDH、β-actin或β-tubulin可以满足要求，而如果需要检测亚细胞器蛋白时，适宜选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。比如常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone H3。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为ATP1A1。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
以上原则仅针对通常情况，需要特别注意的是内参的选择还须考虑实际实验环境状况，比如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此种状况下GAPDH不适合做内参；在涉及细胞增殖相关实验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；在凋亡实验中，TBP、Lamin B等不适合作为核内参。因此在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。
10. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，使用低浓度胶，如低至6％。提高转移电压／电流，增加转移时间。
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